中文摘要：
硫(sulfur)是一种含量丰富的,具有多种化合价位,化学符号为S的非金属元素。在自然环境中,单质硫会形成具有化学式S8的环状八原子分子。元素硫在室温条件下是亮黄色结晶固体。在化学上,其可与除金,铂,铱,碲和稀有气体之外的所有元素反应。以质量计,硫是宇宙中第十大常见的元素,是地球上第五大常见元素。地球上的硫通常以硫化物和硫酸盐矿物的形式存在。元素硫可用于制造火柴,杀虫剂和杀真菌剂。硫是所有生命体必不可少的元素,它是生物化学功能所需的核心化学元素之一,是所有生物体的元素中的常量营养素。元素硫会以各种各样的硫化物形式参与到生物体的生命进程中。近年来,硫化氢(H2S)被认为是继NO,CO之后的第三类气体信号分子,可以参与细胞内的信号传递等生理功能。适当浓度的H2S可以参与调控血管舒张或收缩,抗炎症和抗氧化,甚至可以抑制细胞凋亡;而过高浓度的H2S也可以抑制机体代谢。在有关哺乳动物细胞的研究中,H2S可以抑制呼吸链进而干扰动物呼吸系统乃至中枢神经系统的正常功能,也可以抑制细胞色素c的功能,影响生物正常代谢。但H2S并不具备直接和-SH反应生成过硫化物的能力,因此被质疑不能直接行使信号分子的功能。活性硫烷硫有比H2S更好的生物学活性,具有更强的亲核性质和单电子还原剂活性。和H2S相比,活性硫烷硫更具有作为信号分子的潜力。长久以来,H2S都被作为含硫化物发挥生理功能的主体对象,而一直忽略了活性硫烷硫可能在其中起到的作用。H2S和活性硫烷硫经常共存是难以精确区分其产生和功能的主要原因。一方面H2S容易被O2氧化或与含二硫键的小分子物质发生化学反应生成活性硫烷硫;还可以在硫化物氧化酶如硫醌氧化还原酶(SQR)和黄素细胞色素c-硫化物脱氢酶(FCSD)作用下生成活性硫烷硫。另一方面活性硫烷硫在还原性巯基存在的条件下可以生成H2S,导致活性硫烷硫发挥活性时产生一定量的H2S副产物。H2S更容易被观察和检测到,因此错误的将活性硫烷硫的作用归功于H2S,所以很多证明H2S具有生理功能的实验中可能是活性硫烷硫在其中发挥了作用。为了探讨H2s和活性硫烷硫在生物体内的产生和功能,本文以模式菌株E.coli MG1655作为对象进行了一系列的研究。首先我们使用E.coli MG1655静息细胞代谢不同的含硫化合物,实验结果证明L-半胱氨酸是E.coli MG1655胞内H2S和活性硫烷硫的最适代谢底物。高浓度的L-半胱氨酸对细胞来说具有一定的毒性,因此其在胞内的浓度是被严格控制的。细胞中L-半胱氨酸的浓度一般在200 μM左右,大多数细胞中L-半胱氨酸会以GSH的形式储存,其浓度可以达到10 mM。有研究表明E.coli MGl1655可以通过半胱氨酸脱硫氢酶(CDs,包括TnaA,MetC,MalY,CysK,CysM和YhaM)途径和L-半胱氨酸氨基转移酶欧联3-巯基丙酮酸硫转移酶(CAT/MST)途径代谢L-半胱氨酸生成H2S。我们比较了不同的培养条件下CDs和CAT/MST途径对L-半胱氨酸降解的重要性。发现在不同的营养条件下,E.coli对高浓度L-半胱氨酸的解毒策略有所不同。在营养丰富的条件下,E.coli主要通过氨基酸降解蛋白TnaA控制L-半胱氨酸的胞内浓度;在寡营养条件下,E.coli主要通过CAT/MST途径加速L-半胱氨酸向其他氨基酸的转化来降低其浓度。我们也尝试通过敲除L-半胱氨酸代谢基因获得不积累H2S的E.coli,结果并没有成功,说明E.coli有一套复杂的H2S积累机制。经过敲除相关L-半胱氨酸代谢基因,我们得到了 H2S积累量显著增加的菌株E.coli △cysK,H2S积累量显著减少的菌株E coli △cysM,H2S积累量无显著变化的菌株E.coli △sseA。CysK作为主要的利用H2S合成L-半胱氨酸的途径,其缺失导致H2S的积累增加,而CysM途径的缺失意外的使得H2S积累量的轻微降低,其他L-半胱氨酸降解途径对E.coli的H2S积累量影响有限。我们比较了CDs和CAT/MST途径代谢L-半胱氨酸产生H2S机制上的异同。发现在CDs和CAT/MST途径代谢L-半胱氨酸的反应体系中都可以检测到H2S的产生,但是二者的催化机制并不相同。CDs在降解L-半胱氨酸的过程中并不会有活性硫烷硫的生成,而是通过α,β-消除,β-替代或α-氢交换机制催化L-半胱氮酸降解,并生成丙酮酸,H2S和NH3。而CAT/MST途径代谢L-半胱氨酸的直接催化产物是活性硫烷硫,H2S的产生仅仅是活性硫烷硫和多余巯基自发反应的产物。从催化机制上讲,MST和SQR更加相似,MST和SQR的催化活性中心都是半胱氨酸残基,在催化相应底物时都可以在活性中心形成半胱氨酸过硫化物甚至是硫烷硫长链,这个过程中二者都催化了-2价S向0价S的转化。它们还可以将其上的活性硫烷硫转给适当的受体,形成多种多样的含有活性硫烷硫的物质。因此我们认为MST应当和SQR 一样被归类为活性硫烷硫产生酶,而不是H2S产生酶。此外,体外实验表明在没有其他硫受体的情况下,MST可以催化MP生成一定量的S8。但是当含有其他小分子硫醇物质RSH情况下,会生成一系列的RSSnH,并不会有S8的积累。在生理条件下,E.coli MG1655中含有丰富的硫醇物质可以作为活性硫烷硫受体,因此不具备生成S8的客观条件。无论是在体外的酶促实验,还是全细胞代谢L-半胱氨酸实验中,高浓度α-KG可以抑制CAT的活性降低CAT/MST途径对L-半胱氨酸的降解速率。作为辅酶的PLP对CAT/MST途径并没有表现出高浓度抑制效应。CAT/MST的缺失途径虽然不会影响E.coli的H2S积累情况,但是显著降低了细胞内每毫克蛋白所含有的活性硫烷硫含量。为了评估MST在细菌中的重要性,我们评估了 MST在细菌中的保守性和分布情况。结果表明目前已经测序的细菌中有48.2%的基因组含有MST基因,比仅有20.6%左右细菌中含的SQR分布更为广泛。在含有MST的菌株中,97%的菌株中只有一个MST基因;89.2%MST分布在六个门中:其中Gammaproteobacteria 占了 45.4%,Betaproteobacteria 占了 18.3%,Alphaproteobacteria 占了 12.3%,Bacilli 占了 7.3%,Corynebacteriales 占了 6.0%,Streptomycetales占了 1.9%。MST蛋白结构同源性比较低,这与硫转移酶蛋白结构的特点相一致。我们在基因敲除实验中分别得到了 H2S积累量显著增加的菌株E.coli △cycsK,H2S积累量显著减少的菌株E.coli △cysM,H2S积累量无显著变化的菌株E.coli△sseA。这些菌株为我们研究H2S或活性硫烷硫在生理条件下可能的功能提供了研究素材。我们的实验结果表明,在E.coli合成L-半胱氨酸的过程中,CysK和CysM是一种协作竞争关系。CysK和CysM均可以利用H2S合成L-半胱氨酸,因此它们在底物利用上存在一定的竞争关系。在L-半胱氨酸合成方面,二者协同作用维持胞内L-半胱氨酸的含量稳定,任何一方的缺失不会显著导致胞内L-半胱氨酸的减少,但当二者全部缺失会导致胞内L-半胱氨酸的含量的显著降低,甚至抑制细菌的生长。但是E.coli △cysK和E.coli △cysM在H2S积累变化的表型上呈现出了相反的结果,因为二者之间具有一定的竞争关系,即在生理条件下CysK和CysM的功能都可以利用H2S合成L-半胱氨酸,这其中CysK是利用H2S合成L-半胱氨酸的主要途径,CysM是其补充途径。有关于H2S和活性硫烷硫在信号传递方面的争议一直存在。有人认为H2S不具有与硫醇基团(-SH)直接反应的能力,但是活性硫烷硫可与-SH反应生成-SSH,具有良好的信号传递基础。此外和H2S相比,活性硫烷硫具有更好的还原性能力,在一定条件下和H2O2反应更加迅速。有研究表明小分子多硫化物(GSSH,Cys-SSH)的抗氧化能力是其巯基小分子抗氧化能力的10-100倍。实验中E.coli△cysK和E.coli △cysM的H2S积累量的变化并没有影响菌株的抗氧化能力,E.coli △sseA 菌株的胞内每毫克蛋白中所含有的活性硫烷硫含量显著减少伴随着抗氧化能力的显著降低。将可以氧化H2S生成活性硫烷硫的SQR转化入E.coli,得到E.coli(CpSQR)菌株的抗氧化能力显著提高。这些结果都说明活性硫烷硫在抗氧化过程中起到了举足轻重的作用。在GSSH和H2O2反应过程中,我们首次发现了亚硫酸盐和硫代硫酸盐的生成,以此为基础我们提出了新的活性硫烷硫抗氧化机制。此外通过检测H2S积累量变化菌株在抗生素压力下的生长情况,我们的结果并不支持H2S是广谱的抗生素耐受性物质。本文通过比较E.coli中H2S和活性硫烷硫的产生和功能的差异,明确了活性硫烷硫在抗氧化等方面的重要性,提出了新的活性硫烷硫的抗氧化机制,为进一步的研究H2S和活性硫烷硫的功能奠定了一定的理论基础。
