中文摘要：
ε-聚赖氨酸(ε-poly-_L-lysine,ε-PL)是由25-35个_L-赖氨酸单体通过α-羧基和ε-氨基脱水缩合而成的同型_L-赖氨酸链状聚合物。由于其具有pH使用范围宽、热稳定好、抑菌性广、水溶性强以及安全性能高等优点,目前主要作为防腐剂应用在食品防腐和保鲜领域,已经在日本、韩国、美国和中国等国家广泛使用。同时,作为一种新型阳离子生物聚合物,ε-PL还广泛应用于药物载体和生物材料研究。因此,选育ε-PL高产菌株及探究其高产机制,实现低成本、高效率ε-PL发酵生产,为ε-PL的产业化提供技术支撑至关重要。论文以S.albulus M-Z18为出发菌株,首先建立了针对S.albulus培养和ε-PL检测的高通量平台技术;然后,建立了多次抗生素抗性引入的核糖体工程育种技术,并结合基因组重排育种技术,大幅度提高了S.albulus的ε-PL合成能力;随后,借助生理生化分析手段,系统分析了突变株较出发菌株在生理水平上发生的变化;同时,借助比较蛋白质组学技术,系统分析了突变株较出发菌株在蛋白水平上发生的变化,在此基础上通过代谢工程手段进行了验证;最后,借助比较基因组学技术,深入分析了突变株较出发菌株在基因组水平上发生的变化,并初步构建了ε-PL高产代谢图谱。具体研究内容如下:(1)建立了针对S.albulus培养和ε-PL检测的高通量平台技术。以ε-PL产量为指标,考察了24/48深孔板最佳培养体系、深孔板微量培养替代摇瓶培养评估ε-PL产量、深孔板微量培养与摇瓶培养的比较。24孔板及摇瓶产量有比较好的相关性,相关系数R达到了0.812。24/48孔板都可以用酶标仪来测定,分光光度计和酶标仪对摇瓶发酵液产量、分光光度计与酶标仪对摇瓶和24孔板ε-PL发酵液产量测定均显示良好的一致性,相关系数R分别达到了0.924和0.868,以24/48孔板作为微量培养和ε-PL检测的高通量平台具有节约成本、操作简单、处理量大、快捷高效等优点。较传统的方法节约了大量的原材料、缩短了突变体选育周期,能明显提高ε-PL高产突变的选育效率。(2)建立了多次抗生素抗性引入的核糖体工程育种技术,并结合基因组重排育种技术,大幅度提高了S.albulus的ε-PL合成能力。以S.albulus M-Z18为出发菌株,从对链霉菌有高产突变作用的8种抗生素中确定4种有效抗生素,其中链霉素抗性菌ε-PL产量提高幅度最大,故选择链霉素作为多次筛选的抗性标记,经过2轮链霉素抗性筛选,获得了链霉素抗性高产突变菌株S.albulus SS-62,摇瓶产量由1.7 g·L~(-1)提高到3.04 g·L~(-1),是出发菌株的1.79倍,单位菌体合成ε-PL的量是出发菌株的1.33倍。在此基础上,采用基因组重排育种技术获得ε-PL高产突变株S.albulus SG-86,ε-PL产量为4.16 g·L~(-1),相较于初始菌株提高了145%。(3)借助生理生化分析手段,系统分析了突变株S.albulus SS-62较出发菌株S.albulus M-Z18在生理水平上发生的变化。首先比较了高产突变菌株与出发菌M-Z18在菌体形态及分化、链霉素抗性、发酵性能与突变位点等方面的差异,发现高产突变株单菌落形态、孢子及基内菌丝形态、耐链霉素抗性的能力、发酵性能都发生很大变化;此外,高产突变菌株的rps L和rsmG基因都发生了突变;随后,比较了两株菌在ε-PL合成时的代谢流分布、ATP合成和关键酶活性,发现突变菌株SS-62代谢流重新进行了分布,流向前体_L-赖氨酸和ε-PL的通量增加,ATP的合成和关键酶活性均提高。(4)借助比较蛋白质组学技术,系统分析了突变株S.albulus SS-62较出发菌株S.albulus M-Z18在蛋白水平上发生的变化。在S.albulus SS-62中共鉴定到401个蛋白在高产菌的表达量与出发菌株存在显著差异,这些差异表达蛋白主要与碳水化合物代谢、氨基酸代谢和能量代谢有关。这些差异表达蛋白不仅能增强ε-PL碳水化合物代谢、氨基酸代谢和能量代谢,而且能调节转录调控和翻译的相关途径,为合成ε-PL创造了一个更好的细胞代谢环境。在蛋白质组学分析的基础上过量表达ε-聚赖氨酸合成酶,ε-PL分批发酵产量提高了43.3%;过量表达核糖体循环因子,单位菌体合成ε-PL提高了9.7%。(5)借助比较基因组学技术,深入分析了突变株S.albulus SG-86较出发菌株S.albulus M-Z18在基因组水平上发生的变化。结果表明SG-86的基因组比M-Z18少了2.1M左右,SG-86缺失的基因组包括大量的基因缺失,甚至是代谢途径的缺失,基因组重排去除了SG-86中许多与?-PL合成无关的代谢途径,导致SG-86基因的基因组减小,代谢副产物合成减少,而更多的代谢流流向?-PL合成的前体物质_L-赖氨酸,进而提高了?-PL的产量。此外,插入缺失突变有引起细胞的全局性响应。一些与膜蛋白、转运蛋白、转录调控、次级代谢产物合成等相关的基因发生突变。最终,基于比较基因组学的研究,初步构建了ε-PL高产代谢图谱。
